انواع آزمایش های تشخیصی برای عفونت HIV

مقدمه

ویروس نقص ایمنی اکتسابی و یا HIV متعلق به خانواده لنتی ویروس ها بوده و دو نوع ویروس به نام type I و type II از این ویروس دیده می شود.

پاتوژنز این ویروس در سه مرحله عمده پیشرفت می کند:

• حاد
• مزمن

– بیماری ایدز و یا سندرم نقص ایمنی اکتسابی (Acquired Immune Deficiency Syndrome = HIV)

ویــروس HIV ابتدا رده مونوســیت /ماکروفاژ ها را هدف قرار داده و در آن تکثیر میشــود، سپس در لنفوسیتهای +CD4 تکثیــر خود را ادامه میدهــد.

فرد مبتلا به HIV ممکن است در ظاهر سالم به نظر بیاید و براي مدت طولاني هيچ علامتي از بيماري یا عفونت نداشته باشد.

به همین دلیل می توان گفت تنها راه تشخيص عفونتHIV، انجام آزمايش خون است.

از زمانی که ویروس وارد بدن فرد می شود تا هنگامی که پاسخی قابل تشخیص با آزمایش خون ایجاد شود، دوره ی نهفتگی یا دوره پنجره نامیده می شود.

از آنجا که به طور معمول تشخیص این بیماری، با شناسایی آنتی بادی بر علیه ویروس صورت می گیرد، در طول این دوره نتایج آزمایش فرد آلوده به HIV، می تواند منفی گردد. اما علیرغم منفی بودن آزمایش، امکان انتقال ویروس وجود دارد.

در این قسمت نگاهی اجمالی به تعدادی از تست های معمول برای تشخیص HIVانداخته ایم.

به فاصله زمانی بین ورود ویروس HIV به بدن و مثبت شدن یک تست آزمایشگاهی دوره پنجره و یا window period گفته می شود. این زمان وابسته به ماهیت تست ها متفاوت می باشد.

اولین و رایجترین روش تشخیص عفونت، شناسایی آنتی بادی بود که در طول زمان توسعه پیدا کرد.

بدین ترتیب که ابتدا نسل اول EIA (Enzyme Immune Assay) ابداع شد که 8 الی 10 هفته بعد از ابتلا تنها میتوانست آنتی بادی ضــد 1-HIV از کلاس IgG را تشــخیص دهد که البته موارد مثبت و منفی کاذب زیادی در نتایج این تست وجود داشت.

در ادامه نسل دوم تســتهای EIA ابداع شد که میتوانســت به طور تقریبی 4 الــی 6 هفته پس از ابتلا به عفونــت آنت یبــادی IgG را برای هردو نــوع 2/1-HIV تشخیص دهد.

ظهور نسل سوم تستهای EIA قوی تر از دو نســل قبل، علاوه بر آنتی بادی IgG ،میتوانست IgM را نیزتقریباً 3 هفته پس از ابتلا شناســایی کند.

نهایتاً نسل چهارم EIA که علاوه بر آنتی بادیها میتوانســت آنتی ژن P24 را نیز شناسایی کند مورد استفاده قرار گرفت که این تستها توسط FDA تأیید شــده اند و 16 تا 20 روز پس از ابتلا به عفونت میتوانند بیماری را تشــخیص دهند.

تشخیص به موقع و زود هنگام عفونت حاد به جهت شروع زود هنگام دارو درمانی و همچنین کنترل و پیشگیری از شیوع عفونت بســیار با اهمیت است.

الف ) تست های سنجش آنتی بادی :

– آزمون الایزا(Elisa)

– تست وسترن بلات(Western blot test)

نکته:

تست های آنتی بادی، آنتی بادی های علیه ویروس HIV را شناسایی می کنند و قادر به کشف مستقیم ویروس نیستند.

با ورود ویروس به بدن، سیستم ایمنی فرد با تولید آنتی بادی در مقابل عفونت HIV واکنش نشان می دهد. از وجود این آنتی بادی ها برای شناسایی عفونت HIV استفاده می شود.

با توجه به این که مدتی طول می کشد تا این گونه تست ها، وجود آنتی بادی در خون را شناسایی کنند، نتیجه ی مثبت بیانگر مواجهه ی فرد با ویروس در زمان گذشته است.

بنابراین تست های آنتی بادی برای شناسایی موارد ابتلا در مواجهه ی اخیر محدودیت دارند.

از آنجا که آنتی بادی از طریق مادر آلوده وارد بدن جنین شده تا ۱۸ ماهگی در بدن باقی می ماند ،این تست ها برای تشخیص آلودگی در نوزاد مناسب نمی باشند .

این تست ها برای غربالگری:

* زنان در معرض خطر HIV که قبلاً آزمایش HIV نداده اند، باید در زمان زایمان یا بلافاصله بعد از زایمان با یک آزمایش سریع غربالگری شده تا در صورت لزوم، پیشگیری با داروهای ضد رتروویروس برای شیرخوار آغاز شود و یا در زمان زایمان به خانم حامله تجویز شود.

* زمانی که بعد از زایمان وضعیت HIV مادر نامشخص باشد و به خصوص مادر و یا پدر رفتارهای پرخطر داشته باشند، آزمایش سریع نوزاد در اولین فرصت بعد از تولد توصیه می شود تا بتوان پیشگیری با داروهای ضد رتروویروسی را برای نوزاد مواجهه یافته شروع کرد.

* برای نوزادان بی سرپرست و همچنین نوزادان پرورشگاهی که وضعیت مواجهه ی HIV در آنها نامشخص است، آزمایش سریع HIV توصیه می شود.

* در موارد مواجهه با موارد احتمالاً آلوده به HIV، فرد منبع را می توان با آزمایش سریع بررسی نمود تا نیاز به انجام پیشگیری دارویی مشخص گردد.

نتیجه ی مثبت هر تست سریع، می بایست پیش از تشخیص نهایی با یک روش تأییدی دیگر مشخص شوند.

بر اساس دستورالعمل کشوری، در صورت مثبت شدن تست الایزا، مجدداً این تست (ترجیحا با یک کیت آزمایشگاهی دیگر) تکرار شده و اگر باز هم مثبت بود، تست وسترن بلات انجام می شود. مثبت بودن نتیجه ی این تست، نشانه ی ابتلای فرد می باشد.

موارد خاص:

* در صورتی که نتیجه ی الایزا بار اول مثبت و بار دوم منفی شود، با فاصله ی سه ماه مجددا برای فرد آزمایش الایزا انجام می شود و در صورت تکرار نتیجه ی منفی، فرد HIV منفی در نظر گرفته می شود.

* در صورتی که هر دوبار تست الایزا منفی باشد، فرد HIVمنفی در نظر گرفته می شود، مگر این که فرد طی شش ماه اخیر رفتار پرخطر از نظر انتقال HIV داشته باشد. در صورتی که بیمار مواجهه ی اخیر (رفتار پرخطر طی شش ماه گذشته) داشته باشد و نتیجه ی آزمایشات اولیه ی الایزا منفی باشد، این آزمایش باید سه ماه بعد تکرار شود. اگر همه ی این آزمایشات منفی گزارش شدند، می توان بیمار را HIV منفی در نظر گرفت.

* در فردی که عوامل خطر ابتلا به HIV را ندارد ولی نتایج الایزای وی مثبت و وسترن بلات منفی است، نتیجه ی تست الایزا به احتمال زیاد به صورت کاذب مثبت شده است. چنانچه فرد عوامل خطر ابتلا به HIV را داشته و الایزا وی مثبت و وسترن بلات وی منفی گزارش شده، انجام مجدد تست وسترن بلات در یک ماه بعد توصیه می شود. اگر در این تکرار آزمایش باز هم نتیجه ی وسترن بلات منفی شد، می توان فرد را HIV منفی در نظر گرفت.

وسترن بلات آزمایش دقیق تری بوده، اما به دلیل هزینه ی بالاتر به عنوان تست تأییدی در مواردی که دو بار نتیجه ی آزمایش الایزا مثبت شده است، به کار می رود.

ریپا یک آزمون تأییدی دیگر می باشد. این تست مشابه وسترن بلات بوده و در مواردی که سطح آنتی بادی بسیار پایین است و یا هنگامی که نتایج وسترن بلات غیر مشخص است، به کار می رود.

ریپا نیز مانند وسترن بلات، تست پر هزینه ای بوده و انجام آن نیاز به زمان و تخصص دارد.

آزمایشHIV-ELISA

آزمایش استاندارد HIV ٬”تست الایزا” است. این تست٬ استاندارد جهانی برای استفاده در بیمارستان ها، بانک های خون و یا سازمان های انتقال خون می باشد.

این آزمایش مستقیماً خود ویروس را جستجو نمی کند. در این روش، میزان پادتن ( آنتی بادی) هایی که بدن شخص آلوده برعلیه HIV تولید کرده، اندازه گرفته می شود.

تست ELISA نسبتاً آزمایش ارزان و خیلی دقیقی است (اگر چه ۱۰۰٪ نیست).

وقتی که HIV وارد بدن می شود، یک ماده شیمیایی خاصی از سوی سیستم دفاعی تولید می شود که پادتن ( آنتی بادی) نامیده می شود. پادتن ها واکنش بدن نسبت به عفونت می باشند. بنابراین اگر بدن شخصی پادتن علیه HIV تولید کرده باشد، به معنای آن است که شخص به HIV آلوده شده است.

تولید پادتن در بدن به مدت زمان بین چند روز تا سه هفته نیاز دارد.

آزمایشی را که بتوان به نتیجه آن اعتماد کرده و بر اساس آن شخص را نسبت به نوع سلامت خود با اطلاع کرد، دربعضی منابع بین ۶ هفته تا ۶ ماه و بعضی دیگر بین ۸ هفته تا ۶ ماه بعد از ارتباط خطرناک توصیه شده است.

پس از ۲۲ روز از آلودگی با HIV تست الیزا، در ۵۰%موارد مثبت میشود، پس از ۶ هفته در ۹۵%موارد مثبت میشود و در 99% موارد بعد از 3 ماه مثبت می شود.

حساسیت (Sensitivity) الیزا بیش از ۹۹٫۹%است.

برای جلوگیری از نتایج مثبت کاذب٬ نتایج تکرار شده باید بوسیله تست westernblot تایید گردد.

.دلایل نتیجه مثبت کاذب تست الیزا:

تزریق واکسن آنفلوآنزا

بیماریهایی همچون بیماری بافت همبند

انواع زیستی طبیعی (Normal biologic variants)

هـدف اصلـی از آزمونهای تأییدی ، اطمیـنـان از پـاسـخ مـثبت آزمـونهـایـی مـانـنـد الایـزا است کـه جـهـت غـربـالـگـری استـفـاده مـیشـونـد . مـعـمـولتـریـن آزمـون مـورد استـفـاده بـه ایـن مـنظـور ، آزمـون وستـرن بـلات است.

تست Western blot

به عنوان یک آزمون تأیید کننده به کار می رود. که وجود IgG برعلیه چند نوع پروتئین ویروسی را بررسی می کند . این تست نسبت به الایزا اختصاصی تر بوده از حساسیت کمتری برخوردار است .

بعبارتی در این روش پروتئین های HIV type I با ژل الکتروفورز از هم جدا شده و سپس با سرم بیمار واکنش داده و در صورت وجود آنتی بادی بر علیه پروتئین های با منشاء ژنهای gag, pol و env ویروس در سرم واکنش داده و مثبت می شود.

زمان مثبت شدن این تست 35 الی 40 روز بعد از تماس بدن با ویروس HIV می باشد.

از آنجا که آزمایش Western blot نسبتاً گران است و انجام آن نیز مشکل است . ندرتاً به عنوان اولین آزمایش انجام می گیرد و بیشتر در تأیید نتایج مثبت یا مشابه آزمایش ELISA بکار می رود .

اختصاصی بودن (Specificity) تست وسترن بلات وقتیکه با الایزا همراه شود٬ بیش از ۹۹٫۹% است.

تست غربالگری (Screening) که برای HIV استفاده می شود ELISA است.

در ایران جهت غربالگری HIV :

– اولین آزمایش ۸ هفته بعد از رفتار خطرناک

– تکرار آزمایش ۶ ماه بعد از رفتار خطرناک

برای بار اول ۸ هفته بعد از رفتار خطرناک به مراجعه کنندگان توصیه می شود.

ولی به دلیل اینکه سرعت و میزان تولید پادتن خون در بدن افراد متفاوت است و برای انجام آزمایش دقیقی که بتوان به نتیجه آن استنتاج کرد و جواب قطعی را ارائه داد، ۶ ماه بعد از رفتار خطرناک بایستی که آزمایش تکرار شود.

نتایج نامشخص (indeterminate) در تست وسترن بلات در این موارد است:

– مراحل اولیه عفونت با HIV

– آلودگی با HIV-2

– بیماری خودایمنی (Autoimmune disease)

– حاملگی

– تجویز اخیر توکسوئید کزاز

تمامی تستهای مثبت HIV بایستی توسط تستهای تکمیلی بررسی شوند معمولاً (Western blot test) که حاضر شدن جواب آن از چند روز تا چند هفته طول میکشد.

برای انجام تست HIV نیازی به ناشتا بودن نیست.

ب ) تست های سنجش آنتی ژن

– تست RT – PCR

– تست P24 antigen

– تست DNA-PCR & RNA-PCR

نکته: آزمایش ارجح٬ جهت تشخیص آلودگی نوزادان٬ آزمایش RNA-PCR می باشد.

اغلب انواع تستهای HIV از نمونه خون فرد جهت بررسی HIV استفاده می شود اما تستهایی هم وجود دارند که از بزاق دهان و یا ادرار جهت نمونه استفاده می شود.

آزمایش HIV-PCR

به زبان بسیار ساده این آزمایش مستقیماً وجود HIV در خون را جستجو می کند.

کلمه PCR معادل Polymerase Chain Reaction

تست HIV-PCR ژن ویروس (DNA ) را در خون ردیابی می کند. اگر شخصی آلوده شده باشد DNA ویروس ایدز در خون او وجود خواهد داشت.

از آنجایــی که ماده ژنتیکی HIV اولین مارکری اســت که تقریباً 9 الی 11 روز بعد از ابتلا بــه ویروس در خون به مقدار قابل شناســایی میرسد، در نتیجه میتوان از این تســت جهت تشــخیص زودرس این عفونت استفاده کرد

این تســت در تمامــی مراحل عفونت حتــی دوران پنجره و زمانــی که EIA منفی اســت، مثبت میباشــد.

تســت روش دو بــه HIV Nucleic Acid Test (NAT) به دو روش کیفــی و کمی انجام میگیرد.

این تســت زمانی که نتیجهEIA نامشــخص اســت و یا حتی زمانی که فرد مشکوک به عفونت حاد HIV میباشــد و نتیجه تســت EIA آن منفی اســت و یا جهت تأیید عفونــت HIV مزمن، به کار می رود.

تســت همچنین میتواند برای شناسایی عفونت زودرس و حاد در نوزادان از روی نمونه لکه خون خشک شده (DBS) بکار رود.

این تست دارای توانایی شناسایی عفونت، 6 روز زودتر از تشــخیص آنتی ژن p24 و 12 روز زودتر از تســتهای آنتی بادی میباشــد و در مقایســه با blot western حساسیت و اختصاصیت قابل ملاحظه ای دارد.

میزان اطمینان به دقت این تست ۹۵% می باشد. بعضی منابع این آزمایش را دو هفته بعد از داشتن ارتباط خطرناک (ارتباطی که به تماس مشکوک با خون منجر شود) و بعضی دیگر ابتدا ۴ هفته بعد، توصیه می کنند.

معمولاً بین ۵ روز تا یک هفته طول می کشد تا نتیجه این آزمایش دریافت شود.

از نظر هزینه این تست به طور معمول بسیار گران تر از تست HIV-ELISA می باشد.

در طی این آزمایش اجزاء‌ مختلف ویروسی روی نوارهای خاص روی صفحه آزمایش که در سرم فرد مورد آزمایش قرار میگیرد قرار دارند .

اگر سرم پادتن HIV داشته باشد ، به نوارهای ویروسی متصل می شوند ، که باعث تغییر رنگ آنها می شود . گر چه آزمایش HIV در حال حاضر خیلی در دسترس است . غربالگری گسترده انجام نمی پذیرد .

بـا توجه به این که در این آزمون ژنوم ویروس مورد مطـالعه قرار میگیرد لذا در تشخیص زودرس بیماری و یا نوزاد متولد شده از مادر آلوده مفید است .

بخاطر حساس بودن زیاد ، موارد مثبت کاذب این آزمون بالا است. تشخیص مثبت با PCR در هر حال باید با تست سرولوژیک اثبات شود.

اگـرچـه ایـن آزمـون از حـسـاسیت و اخـتصاصیت بسیـار بـالایـی برخـوردار است ، اما انـجـام آن سـاده نـیست و بـه عمـلکرد آزمایشگاه بــایـد دقـیـق بـاشــد و اسـتــفـاده از آن بــرای غـربــالـگـری افـراد جـایـز نـیـست .

مثبت کاذب: ،‌آزمایش درصد کمی از افراد چه با آزمایش الایزا یا وسترن بلات می تواند غلط باشد . امکان دارد تغییر رنگ اندکی در بعضی از افرادی که HIV ندارند مشاهده شود و بطور غلط به عنوان HIV مثبت شناخته شوند .

درصـورتی کـه غـلظت ویـروس کمتـر از ۲۰۰۰ نسخـه در میلیلیتـر باشـد ، احتمـال مثبت کـاذب در تـشخیص HIV وجود دارد.

منفی کاذب :در بعضی موارد آزمایش می تواند علی رغم وجود پادتنها نتواند تغییر رنگ نشان دهد .بنابراین کسی که آلوده به ویروس است اشتباهاً ممکن است منفی تلقی شود .

آنتی ژن P24 :

در این روش آنتی ژن ویروس مورد بــررسی قرار می گیرد . لذا می تواند در تشخیص زود هنگام آلودگی کمک کننده باشد. البته در مراحل عفونت بدون علامت و یا درمان ضد ویروس ، با توجه به اینکه تعداد ویروس موجود در خون کم است ممکن است منفی کاذب داشته باشیم .

این تست بطور اولیه برای غربالگری نمونه‌های خون استفاده می‌شود ولی در برخی مناطق بعنوان تست تشخیصی HIV بکار می‌برند.

آنتی ژن P24 ، یک پروتئین است که جزئی از ساختمان HIV می‌باشد و در مراحل اولیه عفونت، به مقدار زیاد تولید می‌شود و بوسیلة تستهای تشخیصی می‌توان آن را در خون آشکار کرد. تست P24 می‌تواند آلودگی با HIV را قبل از “تست آنتی بادی “HIV آشکار کند بنابراین تست آنتی ژن P24 در تشخیص HIV در مراحل اولیه بکار می‌رود.

تست RNA test:

این تست ماده ژنتیکی خود ویروس HIV را بررسی میکند و جهت غربالگری منابع خون و نیز آشکارسازی ویروس در مراحل اولیه استفاده کرد ( ۹ تا ۱۱ روز پس از در معرض HIV قرار گرفتن) و نیز در موارد بسیار نادر که تستهای آنتی بادی قادر به آشکارسازی آنتی بادی علیه HIV نیستند.

آزمایش میزان ویروس (HIV viral load test) :

این آزمایش٬ میزان HIV های در حال تقسیم را نشان میدهد٬ که با پیشرفت بیماری و نیز پاسخ به درمان ضد ویروسی٬ مرتبط است.

این آزمایش٬ بهترین تست در دسترس برای تشخیص عفونت فعال HIV است. اگرچه نتایج مثبت کاذب٬ معمول است خصوصا وقتیکه میزان ویروس (Viral load) پایین باشد.

یک سری تست هایی تحت عنوان نسل چهارم آزمایش HIV مطرح شده است که ترکیبی از اندازه گیری توام آنتی ژن و آنتی بادی می باشد که به آنها 4th generation Ag/Ab combination assay می گویند که معروفترین آنها:

تست HIV Ag/Ab combo assay:

این تستی با حساسیت بالا برای تشخیص آنتی ژن P24 می باشد. همچنین ویژگی و یا اختصاصیت بیشتری نسبت به سایر تست ها دارد و بعنوان یک تست مطرح در تشخیص عفونت های حاد HIV نام برده می شود.

اختصاصیت تست برای آنتی ژن P24 و آنتی بادی بر علیه HIV type I و HIV type II معادل 99.8% می باشد.

حساسیت آن برای:

– آنتی ژن P24 معادل 94.2%

– آنتی بادی HIV type I معادل 99.6%

– آنتی بادی HIV type II معادل 98.2% می باشد.

این تست زمانی توانایی تشخیص عفونت HIV را دارد که ویرال لود ویروس در خون بالای 170 هزار کپی در هر میلی لیتر خون باشد.

آزمایش کامل خون و یا تست CBC:

در مراحل پیشرفته HIV این موارد شایع است:

کم خونی (آنمی) ٬ کمی نوتروفیلها (نوتروپنی) ٬ کمی پلاکتها (ترومبوسیتوپنی)

تعداد لنفوسیتهای CD4 :

بیشتر از همه بعنوان عامل پیشگویی کننده پیشرفت HIV بکار میرود.

خطر پیشرفت به سمت عفونتهای فرصت طلب ایدز یا بدخیمی ها وقتی که CD4 ها کمتر از ۲۰۰cell/µl باشد٬ بالاست.

درصد لنفوسیتهای CD4

ممکن است درصد CD4 ها قابل اطمینان تر از تعداد آنها باشد.

خطر پیشرفت به سمت عفونتهای فرصت طلب ایدز یا بدخیمی ها وقتی که درصد CD4 ها کمتر از ۲۰%باشد، بالاست.

.تنها راه مطمئن جهت تعیین آلودگی با HIV انجام تست آنتی بادی HIV می‌باشد و از روی علائم بالینی نمی‌توان آلودگی با HV را تعیین کرد.

با توجه به در دسترس بودن روش الایزا و وسترن بلات در ایران و همچنین اختصاصی بودن بالا (موارد مثبت کاذب کمتر)، ملاک تشخیص قطعی آلودگی یک فرد٬ مثبت بودن دو آزمایش ELISA و یک آزمایش Western blot است.